一、实验前准备

1. 试剂准备：

   将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20～25°C）平衡30min以上，确保试剂温度稳定。

   注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2. 微孔板处理：

   取出所需数量的微孔板，将不用的微孔板放回原锡箔袋中，与提供的干燥剂一起重新密封，并保存于2～8°C。切勿冷冻。

3. 洗涤液准备：

   洗涤液在使用前也需回温至室温。

   
   

二、实验过程

1. 加样与加标：

   编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

   加样：加入标准品/样本100μL到对应的微孔中，然后加伊维菌素抗试剂50μL/孔，轻轻振荡混匀。

2. 反应与温浴：

   使用盖板膜将微孔板盖好，置于25°C避光环境中反应30min。

   注意温浴时间应遵守试剂盒规定，以保证反应充分进行。

3. 洗涤：

   小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤液250μL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s。

   用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。

4. 显色：

   加入底物液A液50μL/孔，再加底物液B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应15min。

   底物是光敏感的，要在临用前现配。

5. 测定：

   加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀。

   设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测），测定每孔OD值（若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定）。

   测定应在加入终止液后的5min内完成，以保证数据准确性。

   
   

三、注意事项归纳

1. 温度控制：确保试剂和样本在检测前达到室温，温浴时间严格遵守试剂盒规定。

2. 洗涤：洗涤步骤是实验的关键，确保洗涤彻底，减少非特异性吸附。

3. 底物处理：底物需临用前现配，并避免长时间暴露于光下。

4. 加样准确性：注意加样量的准确性，尽量使用量程和需要量接近的移液枪，减少误差。

5. 平行实验：建议进行双孔平行实验，以提高数据的准确性。

6. 结果判定：若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。

   
   

遵循以上注意事项，可以确保伊维菌素含量检测的准确性和可靠性。