大肠菌群测试片具体操作步骤：

一、样品前处理

‌样品均质‌

固体样品（如食品、蔬菜）：称取25g样品，加入225mL无菌磷酸盐缓冲液或生理盐水，用均质器以8000~10000r/min均质1~2分钟，制成1:10匀液‌。

液体样品（如河水、饮品）：取25mL样品与225mL稀释液混合，充分振摇或均质后形成1:10匀液‌。

调节pH：必要时用1mol/L NaOH或HCl调节匀液pH至6.8~7.2。

‌梯度稀释‌

用无菌吸管吸取1:10匀液1mL，注入含9mL稀释液的无菌试管中，制成1:100匀液；重复操作制备更高稀释度（如1:1000、1:10000）‌。

根据样品污染预估选择2~3个适宜稀释度进行后续检测‌。

二、测试片接种

‌揭膜与加样‌

将测试片平放于无菌台面，揭开上层薄膜‌。

用无菌吸管或移液器吸取目标稀释度的样品匀液1mL，垂直滴加至测试片中央区域‌。

‌覆盖与排气泡‌

缓慢盖上上层膜，避免产生大气泡（边缘小气泡不影响结果）‌。

餐具表面采样（如配餐企业检测）：用无菌生理盐水湿润测试片后贴于餐具内侧，30秒后取下培养‌。

三、培养与结果判读

‌培养条件‌

将测试片正面向上放入恒温培养箱，36℃±1℃培养18~24小时‌。

耐热大肠菌群检测需在44.5℃高温下培养‌。

‌结果判定‌

‌总大肠菌群‌：红色菌落总数‌。

‌大肠杆菌‌：特异性β-葡萄糖苷酶底物使菌落显蓝色‌。

显色反应：大肠菌群代谢产酸产气，菌落显红色或蓝色，周围伴随气泡‌。

计数规则：选取菌落数15~150CFU的稀释度，计算每克（或毫升）样品中的大肠菌群数‌。

四、质量控制

‌空白对照‌：每批次检测需同步接种1mL无菌稀释液作为阴性对照‌。

‌验证试验‌：对可疑菌落可进一步接种BGLB肉汤管观察产气，或通过革兰氏染色确认‌。

关键操作注意事项

样品均质：

均质时间应控制在2分钟以内，以避免过热破坏微生物的活性。

稀释液选择：

优先使用磷酸盐缓冲液，或者使用生理盐水，以维持渗透压的稳定。

接种量控制：

需要精确移取1mL的样品匀液，避免液体残留影响膜层的吸附。

培养温度：

严格控制温度在±1℃的范围内，因为高温偏差可能导致假阴性或假阳性的结果。

结果时效性：

在培养后2小时内完成计数，以避免菌落过度生长导致颜色模糊，影响结果的准确性。